Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos

Abstract This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Resumo Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P 0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P 0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P 0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Ex vivo retrieval of mature oocytes for fertility preservation in a patient with bilateral borderline ovarian tumor / Recuperação ex vivo de oócitos maduros para preservação da fertilidade em paciente com tumor ovariano borderline bilateral

Abstract We report a case of ultrasound-guided ex vivo oocyte retrieval for fertility preservation in a woman with bilateral borderline ovarian tumor, for whom conventional transvaginal oocyte retrieval was deemed unsafe because of the increased risk of malignant cell spillage. Ovarian stimulation with gonadotropins was performed. Surgery was scheduled according to the ovarian response to exogenous gonadotropic stimulation; oophorectomized specimens were obtained by laparoscopy, and oocyte retrieval was performed ~ 37 hours after the ovulatory trigger. The sum of 20 ovarian follicles were aspirated, and 16 oocytes were obtained.We performed vitrification of 12 metaphase II oocytes and 3 oocytes matured in vitro. Our result emphasizes the viability of ex vivo mature oocyte retrieval after controlled ovarian stimulation for those with high risk of malignant dissemination by conventional approach.

Resumo Relatamos um caso de obtenção ex vivo de óvulos, guiada por ultrassonografia, para preservação da fertilidade em uma mulher com tumor ovariano borderline bilateral, para quem a recuperação transvaginal convencional foi considerada insegura, devido ao aumento do risco de disseminação de célulasmalignas. Foi realizada estimulação ovariana com gonadotrofinas. A cirurgia foi agendada de acordo com a resposta ovariana à estimulação gonadotrófica exógena; após ooforectomia por laparoscopia, ~ 37 horas após a maturação folicular, procedeu-se à recuperação extracorpórea de oócitos. Umtotal de 20 folículos ovarianos foi aspirado e 16 complexos cumulus foramobtidos, resultando na vitrificação de 12 oócitos maduros e de 3 oócitos imaturos amadurecidos in vitro. Nosso resultado enfatiza a viabilidade da recuperação ex vivo de oócitos maduros após estimulação ovariana controlada para mulheres com alto risco de disseminação maligna pela captação oocitária realizada convencionalmente pela via transvaginal.

Freeze-all policy for in vitro fertilization in women with normal response to ovarian stimulation / Congelamento de todos os embriões em ciclos de fertilização in vitro em mulheres com resposta normal à estimulação ovariana

ABSTRACT Objective To answer the question if the freeze-all strategy and subsequent frozen embryo transfer is preferable to fresh embryo transfer for patients with normal response to ovarian stimulation (4 to 15 oocytes recovered) during in vitro fertilization treatments. Methods A retrospective cohort from two human reproduction centers between 2013 and 2017. A total of 471 frozen embryo transfers from freeze-all cycles, and 3,208 fresh transfers were included. Results After propensity score matching adjustment for age and number of eggs, 467 freeze-all cycles and 934 fresh cycles were analyzed, revealing no statistically significant difference between groups in relation to clinical pregnancy rate (32.5% in the Freeze-all Group and 32.3% in the Fresh Group, p=0.936). For women aged 40 years and older, we observed a statistically significant higher clinical pregnancy rate when freeze-all strategy was used (29.3% in the Freeze-all Group and 19.8% in the Fresh Group, p=0.04). Conclusion Freeze-all strategy was not superior to fresh transfer for all patients with normal response to ovarian stimulation. However, women aged 40 years and older could benefit from this strategy. This deserves further investigation in future research, preferable in a prospective randomized study.

RESUMO Objetivo Responder à pergunta se a estratégia freeze-all (congelamento de todos os embriões) e subsequente transferência de embriões congelados é preferível à transferência de embriões a fresco em pacientes com resposta normal à estimulação ovariana (4 a 15 ovócitos coletados) durante tratamentos de fertilização in vitro . Métodos Coorte retrospectiva de dois centros de reprodução humana entre 2013 e 2017. No total, foram incluídas 471 transferências de ciclos com congelamento de todos os embriões, e 3.208 transferências a fresco. Resultados Após o ajuste do escore de propensão para idade e número de óvulos, foram analisados 467 ciclos com congelamento de todos os embriões e 934 ciclos a fresco, não havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à taxa de gravidez clínica (32,5% no Grupo Freeze-all e 32,3% no Grupo a Fresco, p=0,936). Para mulheres com 40 anos ou mais, observamos uma taxa de gravidez clínica estatisticamente maior quando foi utilizada a estratégia freeze-all (29,3% no Grupo Freeze-all e 19,8% no Grupo a Fresco, p=0,04). Conclusão A estratégia freeze-all não foi superior à transferência a fresco para todas as pacientes com resposta normal à estimulação ovariana. No entanto, mulheres com 40 anos ou mais podem ter algum benefício com essa estratégia. Isso justifica uma investigação mais aprofundada em pesquisas futuras e, de preferência, em estudos prospectivos randomizados.

Avaliação da técnica de vitrificação de ovários de camundongos da linhagem B6D2F1, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos - ICTB/Fiocruz-RJ / Evaluation of ovary vitrification technique from B6D2F1 strain belonging to the Institute of Biomodels Science and Technology ICTB / Fiocruz-RJ

Objetivou-se testar a vitrificação de ovários de camundongos do ICTB/Fiocruz. Inicialmente, fez-se coleta e maturação in vitro dos oócitos de ovários a fresco e vitrificados, bem como avaliação de estruturas no cultivo embrionário, pós-fertilização in vitro. Fêmeas B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e divididas em três grupos: grupo 1 (n=30 animais) - oócito de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro (120 fragmentos); grupo 2 (n=15) (controle 1) - oócitos coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro; e grupo 3 (n=15) (controle 2) - oócitos maturados in vivo e fertilizados in vitro. A técnica foi verificada no desenvolvimento embrionário in vitro, que foi avaliado pelo teste de qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperaram-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões ≥ 2 células) entre G1 (8%) e G2 (32%) (P<0,1) e G1 e G3 (49%) (P<0,05), mas não entre G2 e G3 (P>0,05). Para blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (P<0,05). A vitrificação de ovários, a maturação oocitária e a fertilização in vitro são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.(AU)

This work aimed test ovarian vitrification of hybrid mouse from ICTB/Fiocruz. Protocol collection and oocyte in vitro maturation from fresh and vitrified ovaries was established and embryos were evaluated after fertilization. B6D2F1 females were euthanized for ovarian removal (n= 60) and divided into 3 groups: G1 (n= 30) - ovaries fragmented (n= 120), vitrified, matured and fertilized; G2 (n= 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries; G3 (n= 15) - ampulla region oocytes in vitro fertilizated. Viability was verified by thawing, oocyte in vitro maturation and fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by Chi-square test (BioStat 5.0). 123, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significant differences were observed in cleavage rates at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (P< 0.1) and G1 and G3 (49%) (P< 0.05) but not between G2 and G3 (P> 0.05). Blastocysts at 96 hours presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (P< 0.05). Ovary vitrification, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization were available for the production of in vitro mouse embryos.(AU)

Combination of ethylene glycol with sucrose increases survival rate after vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) / Combinação de etilenoglicol com sacarose aumenta a taxa de sobrevivência após a vitrificação de tecido somático de catetos (Pecari tajacu Linnaeus, 1758)

The cryopreservation of somatic tissue in collared peccaries promotes an alternative source of genetic material of this specie. The solid-surface vitrification (SSV) is a great option for tissue conservation; nevertheless, the optimization of SSV requirements is necessary, especially when referred to cryoprotectants that will compose the vitrification solution. Therefore, the aim was to evaluate the effect of the presence of 0.25 M sucrose in addition to different combinations (only or association) and concentrations (1.5 M or 3.0 M) of ethylene glycol (EG) and/or dimethyl sulfoxide (DMSO) in the somatic tissue vitrification of collared peccaries. Subsequently, we tested six combinations of cryoprotectants with or without sucrose in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) plus 10% fetal bovine serum (FBS). Thus, 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7%) and dermis (34.5 vs. 36.6%), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) ratio (0.09 vs. 0.17%) and nucleus area (15.4 vs. 14.5 µm2) respectively. In conclusion, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose and 10% FBS resulted in a better cryoprotectant composition in the SSV for somatic tissue of collared peccaries.(AU)

A criopreservação de tecido somático em catetos promove uma fonte alternativa de material genético nesta espécie. A vitrificação em superfície sólida (VSS) é uma ótima opção para a conservação do tecido; contudo, a otimização dos requerimentos da VSS é necessária, especialmente quanto aos crioprotetores que irão compor a solução de vitrificação. Portanto, o objetivo foi avaliar o efeito da presença de 0,25 M de sacarose em adição com diferentes combinações (individual ou associação) e concentrações (1,5 M ou 3,0 M) de etilenoglicol (EG) e/ou dimetilsulfóxido (DMSO) na vitrificação de tecido somático de catetos. Subsequentemente, nós testamos seis combinações de crioprotetores com ou sem sacarose em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Assim, 3,0 M de EG com sacarose foi capaz de manter as características normais do tecido comparado com o não vitrificado (controle), especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7%) e derme (34,5 vs. 36,6%), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0), razão da região argirófila organizadora de nucléolo (AgNOR) (0,09 vs. 0,17%) e área do núcleo (15,4vs.14,5 µm2), respectivamente. Em conclusão, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose e 10% de SFB resultaram na melhor composição de crioprotetores na VSS para tecido somático de catetos.(AU)

Influência da Concentração e do Tempo de Condicionamento com Ácido Hidrofluorídrico na Rugosidade e Morfologia Superficial de uma Zircônia Glazeada / Influence of Hydrofluoric Acid Concentration and Etching Time on the Surface Roughness and Morphology of a Glazed Zirconia

Objetivo: Avaliar o efeito da concentração e do tempo de condicionamento com ácido fluorídrico na rugosidade e morfologia superficial de uma zircônia glazeada. Materiais e Métodos: Blocos de cerâmica à base de zircônia (5×5×3 mm) (Vita YZ-2000-Cubes, Vita- Zahnfabrik, Alemanha) foram confeccionados e divididos em 6 grupos, de acordo com os fatores "concentração do ácido fluorídrico (HF)" (5% e 10%) e "tempo de condicionamento" (20 s, 60 s e 90 s) (n=2): HF10/20 = HF 10% + 20 s; HF10/60 = HF 10% + 60 s; HF10/90 = HF 10% + 90 s; HF5/20 = HF 5% + 20 s; HF5/60 = HF 5% + 60 s; HF5/ 90 = HF 5% + 90 s. O glaze (Vita Akzent, Vita-Zahnfabrik, Alemanha) foi aplicado com o auxílio de um pincel e sinterizado de acordo com as recomendações do fabricante. Após os diferentes protocolos de condicionamento, foram aferidas cinco medições de rugosidade (Ra) para cada espécime em Perfilômetro Digital (Wyko®, Modelo NT- 1100, Veeco, EUA). Os dados (µm) obtidos foram analisados estatisticamente com análise de variância (ANOVA 2-fatores) e Teste de Tukey (95%). Resultados: O fator "concentração do ácido fluorídrico" (p=0,149) não foi significante estatísticamente. No entanto, o fator "tempo de condicionamento" (p=0,009) foi significante. A interação entre os fatores também apresentou significância estatística (p=0,00). As médias de rugosidade (±desvio-padrão) obtidas foram (µm): GHF10/20=1,94(±0,72)A, GHF5/90=1,92(±0,19)A, GHF5/ 20=1,38(±0.48)AB, GHF5/60=1,18(±0,63)B, GHF10/60=1,17(±0,30)B, GHF10/90=0,82(±0,27)B (Tukey). Conclusão: Conclui-se que o ácido fluorídrico (10%) em maior concentração, associado a um menor tempo de condicionamento (20 s), promoveu maior rugosidade superficial da zircônia glazeada. (AU)

Objective: The aim of this study was to evaluate the effect of different etching protocols on the surface roughness of a glazed zirconia. Material and Methods: Zirconia ceramic-blocks (5 × 5 × 3 mm) (Vita YZ-2000-Cubes, Vita-Zahnfabrik, Germany) were prepared and divided into 6 groups according to the variables "concentration of hydrofluoric acid (HF)" (5 % and 10 %) and " etching time " (20 s, 60 s and 90 s) (n = 2), as follows: HF10/20 = HF 10% + 20 s; HF10/60 = HF 10% + 60 s; HF10/90 = HF 10% + 90 s; HF5/20 = HF 5% + 20 s; HF5/60 = HF 5% + 60 s; HF5/90 = HF 5% + 90 s. The glaze (Vita Akzent, Vita- Zahnfabrik, Germany) was applied with a brush and sintered according to the manufacturer's recommendations. After different etching protocols, five roughness (Ra) measurements were taken for each specimen in a digital profilometer (Wyko ®, Model NT-1100, Veeco, USA). The data were statistically analyzed using analysis of variance (ANOVA 2­way) and Tukey's test (95%). Results: The variable "concentration of hydrofluoric acid" (p=0.149) was not statistically significant, while the variable "etching time" (p=0.009) was significant. The interaction between variables was statistically significant (p = 0.00). The roughness averages (± standard deviation) obtained were (µm): GHF10/20=1.94(±0.72)A, GHF5/90=1.92(±0.19)A, GHF5/ 20=1.38(±0.48)AB, GHF5/60=1.18(±0.63)B, GHF10/60=1.17(±0.30)B, GHF10/90=0.82(±0.27)B (Tukey). Conclusion: It can be concluded that hydrofluoric acid (10%) at a higher concentration associated with a lower etching time (20 s) promoted higher superficial roughness on glazed zirconia. (AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Follicle Viability after Vitrification of Bovine Ovarian Tissue / Viabilidade folicular após a vitrificação de tecido ovariano bovino

Abstract Purpose The present study aimed to evaluate the impact of vitrification on the viability of follicles using a three-dimensional (3D) in vitro culture. Methods Bovine ovarian tissue samples (n = 5) obtained from slaughterhouses were utilized. The cortex was cut into small fragments of 2 x 3 x 0.5 mm using a tissue slicer. From these fragments, secondary follicles were first isolated by mechanical and enzymatic methods, then encapsulated in alginate gel and individually cultured for 20 days. Additional fragments of the same ovarian tissue were vitrified in a solution containing 25% glycerol and 25% ethylene glycol. After warming, the follicles underwent the same follicular isolation process that was performed for the fresh follicles. Results A total of 61 follicles were isolated, 51 from fresh ovarian tissue, and 10 from vitrified tissue. After the culture, the vitrified and fresh follicles showed 20% and 43.1% survival rates respectively (p = 0.290),with no significant differences. At the end of the culture, therewere no significant differences in follicular diameter between the vitrified (422.93 ± 85.05 μm) and fresh (412.99 ± 102.55 μm) groups (p = 0.725). Fresh follicles showed higher mean rate of antrum formation when compared with vitrified follicles (47.1% and 20.0% respectively), but without significant difference (p = 0.167). Conclusions The follicles were able to develop, grow and form antrum in the 3D system after vitrification, despite the lower results obtained with the fresh tissue.

Resumo Objetivo O presente estudo teve como objetivo avaliar o impacto da vitrificação na viabilidade dos folículos utilizando a cultura in vitro tridimensional (3D). Métodos Foi utilizado tecido ovariano bovino (n = 5) obtido de abatedouros. O córtex foi cortado em pequenos fragmentos de 2 x 3 x 0,5 mm, utilizando o tissue slicer e a partir destes fragmentos foram isolados folículos secundários por meio de método enzimático e mecânico, encapsulados em gel de alginato e cultivados individualmente durante 20 dias. Outros fragmentos do mesmo tecido ovariano foram vitrificados em solução contendo 25% de glicerol e 25% de etilenoglicol. Após aquecimento, os folículos passaram pelo mesmo processo de isolamento folicular realizado a fresco. Resultados Foram isolados 61 folículos, sendo 51 originários de tecido ovariano a fresco, e 10 de tecido vitrificado. Após a cultura, os folículos vitrificados apresentaram taxa de sobrevida de 20%, e o grupo a fresco apresentou taxa de 43,1% (p = 0,290). O diâmetro folicular ao final da cultura também não apresentou diferença significativa entre o grupo vitrificado (422,93 ± 85,05 μm) e a fresco (412,99 ± 102,55 μm) (p = 0,725). Os folículos a fresco apresentarammaior taxa média de formação de antro do que os folículos vitrificados (47,1% e 20,0%, respectivamente), mas sem diferença significativa (p = 0,167). Conclusões Os folículos foram capazes de se desenvolver, crescer e formar antro em sistema 3D após a vitrificação.

Lipid content and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with forskolin before vitrification / Acúmulo de lipídios intracitoplasmáticos, desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro e tratados com diferentes concentrações de forskolin antes da vitrificação

The aim of the present study was to evaluate the intracytoplasmic lipid content, development and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with different concentrations of forskolin before vitrification. Embryos were produced from abattoir-derived ovaries and allocated into four groups. In the treatment groups, forskolin was added to the in vitro culture medium on Day 6 and incubated for 24 hours in one of the following concentrations: 2.5µM (Forsk 2.5 group), 5.0µM (Forsk 5.0 group) or 10.0µM (Forsk 10.0 group). Embryos from the control group were cultured without forskolin. On Day 7 of culture, the expanded blastocysts were stained with the lipophilic dye Sudan Black B for determination of the intracytoplasmic lipid content or were cryopreserved via the Vitri-Ingá® procedure. Although there were no significant differences (P>0.05) in the blastocyst rates between the Control group (44.9%) and the other treatments, the embryo production was lower (P<0.05) in Forsk 10.0 group (38.8%) compared to Forsk 2.5 (50.5%) and Forsk 5.0 (54.7%) groups. The intracytoplasmic lipid content (expressed in arbitrary units of pixels) in blastocysts from the Control group (1.00±0.03) was similar (P>0.05) to that found in Forsk 2.5 (0.92±0.03) and Forsk 10.0 groups (1.06±0.03) groups; however the lipid accumulation in blastocysts from Forsk 5.0 group (0.82±0.04) was lower than in the Control group (P<0.05). Based on these results, Forsk 5.0 treatment was tested for cryotolerance and it was observed that the blastocoel re-expansion rate evaluated 24 hours after warming was greater (P<0.05) in Forsk 5.0 group (72.2%) compared to the Control group (46.2%). In conclusion, pre-treatment with forskolin at a concentration of 5.0 µM for 24 hours before vitrification is effective in reducing the intracytoplasmic lipid content and, consequently, improves cryotolerance of IVP bovine embryos.(AU)

Os embriões foram produzidos a partir de ovários obtidos em abatedouro e foram alocados em quatro grupos experimentais. Nos grupos tratados, o forskolin foi adicionado ao meio de cultivo in vitro no dia 6 do cultivo e os embriões foram incubados durante 24 horas com uma das seguintes concentrações: 2,5µM (grupo Forsk 2,5), 5,0µM (grupo Forsk 5,0) ou 10,0µM (grupo Forsk 10,0). Os embriões do grupo controle foram cultivados na ausência de forskolin. No dia 7 do cultivo, os blastocistos expandidos foram corados com o corante lipofílico Sudan Black B para a determinação do teor de lípidos intracitoplasmáticos ou foram criopreservados através do protocolo Vitri-Ingá®. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) na taxa de produção de blastocistos entre o grupo Controle (44,9%) e os demais tratamentos, todavia observou-se menor produção de embriões (P<0,05) no grupo Forsk 10,0 (38,8%) em comparação com os grupos Forsk 2,5 (50,5%) e Forsk 5,0 (54,7%). A quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos do grupo Controle (1,00±0,03) foi semelhante (P>0,05) a dos grupos Forsk 2,5 (0,92±0,03) e Forsk 10,0 (1,06±0,03); no entanto, o acúmulo de lípidos nos blastocistos do grupo Forsk 5.0 (0,82 ± 0,04) foi menor do que no grupo controle (P<0,05). A partir destes resultados, o grupo Forsk 5,0 foi testado quanto à criotolerância e foi observado que a taxa de re-expansão da blastocele 24 horas após o aquecimento foi maior (P<0,05) no grupo Forsk 5,0 (72,2%) quando comparado ao grupo Controle (46,2%). Em conclusão, o pré-tratamento com forskolin na concentração de 5,0 µM durante 24 horas antes da vitrificação foi eficiente para promover a redução da quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos e, consequentemente, melhorou a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro.(AU)

Crianças nascidas após vitrificação de oócitos em reprodução assistida em hospital público / Infants live born after oocytes vitrification in assisted reproduction public hospital

A criopreservação de oócitos contribuiu para o avanço das técnicas em reprodução humana nas últimas décadas. A metodologia tem sua aplicação na preservação da fertilidade, em programas de ovodoação, como estratégia para redução do número de embriões extranumerários criopreservados com manipulação de menor número de oócitos a fresco e para acúmulo de oócitos em ciclos com reduzida resposta ovariana. A partir do princípio de que todo cidadão tem direito a saúde, é dever do Estado garantir o acesso a todos os tipos de tratamento. O Centro de Referência da Saúde da Mulher ­ Hospital Pérola Byington implantou a técnica de vitrificação de oócitos em 2010, aprimora os protocolos continuamente e busca melhores taxas de sobrevida, fertilização, clivagem e gestação. Relatamos as duas primeiras gestações, com nascimento, obtidas a partir de oócitos vitrificados em nosso Centro, que comprovam a viabilidade da aplicação dessa técnica e oferecem, assim, atendimento ao público com equidade e gratuidade integral.(AU)

The oocytes cryopreservation contributed substantially to a breakthough in Assisted Human Reproduction techniques over the last three decades. The methodology has been applied in the fertility preservation, through oocyte donation programmes, as strategy to reduce the number of supernumerary embryos cryopreserved by manipulating the least amount of fresh oocytes, and in the accumulation of oocytes in cycles with poor ovarian responders. Assuming the principle that every citizen has the right to health, it is the duty of the State to ensure access to all types of treatment. The Woman's Health Reference Center ­ Pérola Byington Hospital has implemented the technique of oocytes vitrification since 2010, and has been improving our protocol continuously: aiming at improvements in the rates of survival, fertilization, cleavage and pregnancy. We reported the first two pregnancies, infants live born after oocytes vitrification, at our Center, proving the feasibility of the oocytes vitrification protocol applied, offering service to the public with equity and no cost for the patient.(AU)

Effect of ß-mercaptoetanol and cysteine on post-thawing quality and oxidative activity of ram sperm and on the viability of vitrified sheep embryos / Efeito do ß-mercaptoetanol e da cisteína sobre a qualidade e a atividade oxidativa do sêmen ovino após o descongelamento e sobre a viabilidade de embriões ovinos vitrificados

The effects of ß-mercaptoethanol (BME) and cysteine on the viability and oxidative activity of ram sperm after thawing and on development in vitro and viability of vitrified sheep embryos were evaluated. Ejaculates from four rams were pooled and extended, composing six treatments: no antioxidants; 2mM BME; 5mM BME; 2mM BME and 5mM cysteine; 5mM BME and 5mM cysteine; and 5mM cysteine. Sperm motility, membrane and acrosome integrity, mitochondrial functionality, production of reactive oxygen species and total antioxidant capacity were similar across treatments (P>0.05). A medium with no antioxidant presented cleavage and blastocyst development rates (60.3% and 33.6%, respectively) similar (P>0.05) to those of a medium with 50µM BME and 600µM cysteine (64.3% and 36.6%, respectively). Post-thawing viability of vitrified embryos was similar between media (P>0.05). Cysteine and BME had no influence on the post-thawing viability and oxidative activity of ram sperm and on the viability of vitrified sheep embryos.(AU)

Foram avaliados os efeitos do ß-mercaptoetanol (BME) e da cisteína sobre a viabilidade e a atividade oxidativa após o descongelamento do sêmen ovino e sobre o desenvolvimento in vitro e a viabilidade de embriões ovinos vitrificados. Ejaculados de quatro carneiros foram agrupados e diluídos, compondo seis tratamentos: sem antioxidantes; com BME 2mM; com BME 5mM; com BME 2mM e cisteína 5mM; com BME 5mM e cisteína 5mM; e com cisteína 5mM. Motilidade, integridade da membrana e do acrossoma, função mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio e capacidade antioxidante total foram semelhantes entre os tratamentos (P>0,05). Em um meio sem antioxidantes, as taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário até blastocisto (60,3%, e 33,6%, respectivamente) foram semelhantes (P>0,05) às obtidas em um meio com BME 50µM e cisteína 600µM (64,3% e 36,6%, respectivamente). A viabilidade pós-descongelamento dos embriões vitrificados não diferiu entre os meios (P>0,05). O BME e a cisteína não influenciaram a viabilidade e a atividade oxidativa do sêmen ovino após o descongelamento e a viabilidade de embriões ovinos vitrificados.(AU)

Comparison between Slow Freezing and Vitrification in Terms of Ovarian Tissue Viability in a Bovine Model / Comparação da viabilidade do tecido ovariano após congelamento lento e vitrificação em modelo bovino

Abstract Objective To assess the viability of bovine ovarian tissue after cryopreservation through either slow freezing or vitrification, and to compare it to that of control tissue by performing morphological analyses. Methods The study included 20 bovine ovarian cortex fragments that were divided into control, vitrification, and slow freezing groups. Each group consisted of four fragments of the same ovary, two fixed without cultivation, and two fixed with cultivation. Tissues were evaluated based on follicular morphology immediately after heating and after 7 days of culture, and compared with the control group. Results A total of 240 fragments were analyzed, generating a sample of 1,344 follicles without cultivation and 552 with cultivation. When the non-cultivated samples were classified as non-atretic follicles, 572 were found in the control group, 289 in the vitrification group, and 373 in the slow freezing group, showing no significant differences. When classified as atretic, 46 follicles were found in the control group, 23 in the vitrification group, and 41 in the slow freezing group, also showing no statistical difference. In the post-culture sample, an evolution of the follicular stages could be observed. This finding was important to support that the follicles considered non-atretic in the non-cultivated group were actually viable in the morphological evaluation. Conclusion With no differences between the protocols, vitrification was shown to be an advanced and alternative method for patients who will undergo treatments that.

Resumo Objetivo avaliar a viabilidade do tecido ovariano bovino após a criopreservação, utilizando congelamento lento e vitrificação, e comparando com o tecido controle por meio de análises morfológicas. Métodos o estudo incluiufragmentos de córtex de vinte ovários bovinos divididos em grupos controle, vitrificação e congelamento lento. Cada grupo foi composto por quatro fragmentos do mesmo ovário, sendo dois fragmentos fixados sem cultivo e dois fragmentos fixados pós-cultivo. Os tecidos foram avaliados pela morfologia folicular logo após o aquecimento e após sete dias de cultivo, e comparados com o grupo controle. Resultados um total de 240 fragmentos foi analisado, gerando uma amostra de 1.344 folículos sem cultivo e 552 pós-cultivo. Quando a amostra sem cultivo teve seus folículos agrupados em não atrésicos, obtivemos 572 no grupo controle, 289 no vitrificação, e 373 no congelamento lento, não apresentando diferença estatística. Quando agrupados em atrésicos, o grupo controle apresentou 46 folículos, o vitrificação, 23, e o congelamento lento, 41, não apresentando também diferença estatística. Na amostra pós-cultivo, podemos observar uma evolução dos estágios foliculares: esse achado foi importante para sustentar que os folículos considerados não atrésicos na avaliação morfológica sem cultivo estavam realmente viáveis. Conclusão não havendo diferenças entre os protocolos, a vitrificação se mostra um avanço e um método alternativo para pacientes que irão se submeter a tratamentos que podem levar a uma falência ovariana, uma vez que a metodologia é mais barata, mais rápida e mais bem adaptável a uma rotina de um laboratório.

A comparative study on biaxial flexural strength and Vicker`smicrohardness of different zirconia materials: Effect of glazingand thermal cycling / Estudo comparativo da resistência à flexão biaxial e microdureza Vickers` em diferentes materiais à base de zircônia: Efeito doglazeamento e da ciclagem térmica

Objetivo: Este estudo avaliou o efeito do glazeamento e da ciclagem térmica na resistência à flexão biaxial e na dureza Vicker’s de diferentes materiais à base de zircônia. Material e Métodos: Espécimes de disco (15 mm x 1,15 mm) de zircônia foram confeccionados usando 3 sistemas (ZirkonZahn, Cercon, Ceramill) de acordo com a recomendação de cada fabricante. Os espécimes de cada sistema cerâmico foram randomicamente divididos em 2 grupos. Enquanto metade dos espécimes foram glazeados, a outra metade permaneceu não glazeado. Adicionalmente, cada grupo foi divido em 4 subgrupos submetidos a diferentes ciclagens térmicas (0-control, 1000, 3000, 5000 ciclos, 5-55 ºC). A resistência à flexão biaxial foi realizada em uma máquina de teste universal (1 mm/min). As amostras não glazeadas foram submetidas a microdureza Vicker’s antes e após a ciclagem térmica (0-control, 1000, 3000, 5000 cycles, 5-55 ºC). Os dados foram estatisticamente analisados usando ANOVA 1-fator, ANOVA 2-fatores e teste de Tukey’s (p < 0,05). Resultados: Nas amostras não cicladas (1104-1388 MPa), o glazeamento reduziu significativamente a resistência à flexão biaxial de todos os sistemas cerâmicos (845.65-897.35 MPa) (p = 0,000). Enquanto nos grupos não glazeados todas as modalidades de ciclagem térmica reduziram significantemente a resistência à flexão biaxial (864- 1156 MPa) (p = 0,000), nos grupos glazeados a ciclagem térmica não afetou os resultados (829.4- 854.9 MPa) (p = 0,405). Comparados aos grupos não envelhecidos (1414.1 VHN), a ciclagem térmica reduziu significantemente a dureza Vickers apenas para o Cercon (1365.9 VHN) (p = 0,005). Conclusão: O glazeamento reduz a resistência à flexão biaxial dos sistemas à base de zircônia testados. As amostras não glazeadas foram mais afetadas pela ciclagem que as amostras glazeadas. Estas informações podem ter relevância clínica na durabilidade de reconstruções em zircônia monolítica.

Objective: This study evaluated the effect of glazing and thermal cycling on biaxial flexural strength and Vickers hardness of different zirconia framework materials. Material and Methods: Disc shaped zirconia specimens (15 mm x 1.15 mm) were fabricated using three systems (ZirkonZahn, Cercon, Ceramill) according to each manufacturer`s instructions. The specimens of each system were randomly divided into 2 groups. While half of the specimens were glazed, the other half was left unglazed. Each group was further divided into 4 subgroups to be subjected to thermal cycling (0-control, 1000, 3000, 5000 cycles, 5-55 ºC). Biaxial flexural strength was tested in a universal testing machine (1 mm/min). Unglazed zirconia specimens were subjected to Vickers microhardness with and without thermal cycling (0-control, 1000, 3000, 5000 cycles, 5-55 ºC). Data were statistically analyzed using one-way ANOVA, twoway ANOVA and Tukey’s test (p < 0.05). Results: In non-aged conditions (1104-1388 MPa), glazing significantly decreased the biaxial flexural strength of all zirconia ceramics (845.65-897.35 MPa) (p = 0.000). While in the non-glazed groups, all thermal cycling regimens significantly decreased the biaxial flexural strength (864 -1156 MPa) (p = 0.000), in glazed groups thermal cycling did not affect the results (829.4-854.9 MPa) (p = 0.405). Compared to the non-aged group (1414.1 VHN), thermal cycling decreased the Vickers hardness significantly only for Cercon (1365.9 VHN) (p = 0.005). Conclusion: Glazing decreased the biaxial flexural strength of the zirconia ceramics tested. Unglazed zirconia ceramics were weaker against thermal cycling compared to glazed ones. For the long-term durability of monolithic zirconia reconstructions, this information may have clinical significance.

Criopreservación de embriones equinos y primer reporte de un potro de raza criolla colombiana nacido por transferencia de un embrión equino vitrificado / Cryopreservation of Equine Embryos and First Report of a Native Colombian Breed Born by Transfer of an Equine Vitrified Embryo / Criopreservação de embriões equinos e primeiro relatório de um potro de raça crioula colombiana, nascido por transferência de um embrião equino vitrificado

El objetivo de este artículo es informar sobre el éxito de un procedimiento de criopreservación de embriones equinos, a fin de conseguir una preñez viable. Se colectaron embriones equinos al día 6-6,5 (< 300 µm; n = 24) y se sometieron a dos técnicas de criopreservación: grupo 1 (n = 12), vitrificados exponiéndolos a una solución VS1 (Gli [1,4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1,4 M] + EG [3,6 M]) y VS3 (Gli [3,4 M] + EG [4,6 M] 1 min. Se empacaron en pajillas de 0,25 ml y se sumergieron en nitrógeno líquido; grupo 2 (n = 12), congelación lenta: expuestos a una solución de congelación (1,8 M de EG + 0,1 M sucrosa) por 10 min, empacados en pajillas de 0,25 ml, llevados al congelador de embriones, exponiéndolos a una curva de congelación y sumergidos en nitrógeno líquido. Posterior a la descongelación, a los 24 embriones se les removió el crioprotector mediante un paso; fueron sumergidos en medio de cultivo DMEM/F12 + 10% de suero fetal bovino (SFB) e incubados bajo atmosfera controlada (5% CO2, 5% N2 90% O2) por 48 h. Se evaluó el desarrollo embrionario en el 75% de los embriones vitrificados (n = 4); el 20% de los embriones fueron sometidos a congelación lenta (n = 1). No se observaron diferencias significativas en los grupos respecto al desarrollo embrionario, pero sí mayor tendencia de supervivencia en los embriones vitrificados. Igualmente, uno de estos embriones vitrificados fue transferido a una receptora, se logró una preñez viable y el nacimiento de un potro vivo.

The aim of this paper is to report on the success of a cryopreservation procedure of equine embryos to achieve a viable pregnancy. Equine embryos were collected on day 6-6.5 (<300 µm, n = 24) and subjected to two cryopreservation techniques: group 1 (n = 12), vitrified, exposing them to a VS1 (Gli [1.4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1.4 M] + EG [3.6 M]) and VS3 (Gli [3.4 M] + EG [4.6 M] 1 min solution. They were packed in 0.25 ml straws and immersed in liquid nitrogen; group 2 (n = 12), slow freezing: exposed to a freezing solution (1.8 M EG + 0.1 M sucrose) for 10 minutes, packed into 0.25 ml straws, brought to the embryos freezer, exposed to a freezing curve and immersed in liquid nitrogen. Following defrosting, cryoprotectants were removed from the 24 embryos in one step; they were submerged in culture medium DMEM/F12 + 10% of fetal bovine serum (FBS) and incubated under controlled atmosphere (5% CO2, 5% N2 90% O2) for 48 h. Embryonic development was evaluated in 75% of the vitrified embryos (n = 4); 20% of the embryos were subjected to slow freezing (n = 1). No significant difference was observed in the groups regarding embryonic development, but a greater survival tendency on the vitrified embryos was noted. Also, one of these vitrified embryos was transferred to a receiver, achieving a viable pregnancy and the birth of a living foal.

O objetivo deste artigo é informar sobre o sucesso de um procedimento de criopreservação de embriões equinos, a finalidade de conseguir uma prenhez viável. Coletaram-se embriões equinos ao dia 6-6,5 (< 300 µm; n = 24) e se submeteram a duas técnicas de criopreservação: grupo 1 (n = 12), vitrificados expondo-os à uma solução VS1 (Gli [1,4 M]) 5 min, VS2 (Gli [1,4 M] + EG [3,6 M]) e VS3 (Gli [3,4 M] + EG [4,6 M] 1 min. Se empacaram em tubos de 0,25 ml e se submergiram em nitrogênio líquido; grupo 2 (n = 12), congelação lenta: expostos a uma solução de congelação (1,8 M de EG + 0,1 M sacarosa) por 10 min, embalados em tubos de 0,25 ml, levados ao congelador de embriões, expondo-os a uma curva de congelação e submergidos em nitrogênio líquido. Posterior à descongelação, aos 24 embriões foi-lhes foi removido o crio protetor mediante um passo; foram submergidos em meio de cultivo DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino (SFB) e incubados bajo atmosfera controlada (5% CO2, 5% N2, 90% O2) por 48 h. Se avaliou o desenvolvimento embrionário no 75% dos embriões vitrificados (n = 4); o 20% de os embriões foram submetidos a congelação lenta (n = 1). Não se observaram diferenças significativas nos grupos com respeito ao desenvolvimento embrionário, mas sim uma maior tendência de sobrevivência nos embriões vitrificados. Igualmente, um destes embriões vitrificados foi transferido a uma receptora, obteve-se uma prenhez viável e o nascimento de um potro vivo.

Hiperidricidade: uma desordem metabólica / Hyperhydricity: a metabolic disorder

A hiperidricidade, anteriormente chamada vitrificação, é considerada uma desordem fisiológica, bioquímica e morfológica decorrente do acúmulo anormal de água no interior das células e tecidos. As plantas cultivadas in vitro estão, indubitavelmente, sob contínua condição de estresse, os quais resultam em alterações metabólicas características do estresse oxidativo. Anatomicamente, plantas ou brotos afetados frequentemente apresentam-se inchados, com coloração verde claro, folhas translúcidas e com aparência de vidro, baixa relação número de células/área celular e hipolignificação. Alterações fisiológicas que ocorrem nas principais vias metabólicas, incluindo fotossíntese, respiração e transpiração, resultam em redução de eficiência dessas vias metabólicas. Os distúrbios morfológicos, fisiológicos e bioquímicos são desencadeados por fatores físicos, relacionados ao ambiente dos recipientes de cultivo e consistência do meio de cultura ou por fatores químicos como os componentes do meio de cultura, em especial dos reguladores de crescimento em altas concentrações. A hiperidricidade ocorre em vários níveis de severidade, chegando a resultar na perda irreversível da capacidade morfogênica e o estabelecimento de um estado neoplásico das células, no entanto, na maioria dos casos, a hiperidricidade é considerada reversível. Esta revisão foca o conhecimento atual sobre o fenômeno da hiperidricidade abordando aspectos morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e a reversibilidade do processo.

The hyperhydricity, formerly called vitrification, is considered a physiological, biochemistry and morfologic disorder due to abnormal accumulation of water inside the cells and tissues. Plants grown in vitro are undoubtedly under continuous stress condition which results in metabolic changes characteristic of oxidative stress. Anatomically plants or shoots affected often become swollen, with pale green, translucent sheets, glass-like, low relative number of cells / cell area and hipolignification. Physiological changes occur in major metabolic pathways including photosynthesis, respiration and transpiration resulting in reduced efficiency of these metabolic pathways. Morphological, physiological and biochemical disorders are triggered by physical factors related to the environment of cultivation vessels and consistency of the culture medium or by chemical factors such as culture medium components, especially the growth regulators in high concentrations. The hyperhydricity occurs at various levels of severity, reaching result in irreversible loss of morphogenic capacity and the establishment of a state of neoplastic cells, however, in most cases hyperhydricity is considered reversible. This review focuses on the current knowledge about the phenomenon of hyperhydricity addressing morphological, physiological, biochemical, and reversibility of the process.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol / Sobrevivência de embriões de camundongo vitrificados em soluções com dimetilformamida associadas ao etilenoglicol ou 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10 percent v/v of each) in mPBS + 0.5 percent PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20 percent v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P<0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P<0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3 percent-3/108 and 17.1 percent-19/111) (P<0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69 percent-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10 por cento v/v de cada) em mPBS + 0,5 por cento PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20 por cento v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P<0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P<0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3 por cento-3/108 e 17,1 por cento-19/111), em relação à solução EG-PROH (69 por cento-73/105) (P<0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Cryotop no desenvolvimento de oócitos bovinos imaturos vitrificados / Cryotop and development of vitrified immature bovine oocytes

The effectiveness of different cryodevices (open-pulled straw (OPS), electron microscopy grid (EMG), and Cryotop was evaluated for vitrification of immature bovine oocytes. Polar body, metaphase II stage (MII), survivability, and subsequent developmental rates were determined. Only oocytes with four or five layers of cumulus cells were used. Oocytes were equilibrated in two vitrification solutions - 1: 10 percent DMSO + 10 percent ethylene glycol (EG) for 30-45sec and 2: 20 percent DMSO + 20 percent EG +0.5M sucrose for 25sec -, mounted on one of the cryodevices and directly plunged into liquid nitrogen for 10 days. Immature vitrified oocytes using Cryotop showed the highest rates of polar body extrusion (PB) and nuclear maturity (MII); 41 and 58 percent respectively. Vitrified oocytes using OPS and EMG showed 26 and 32 percent; and 35 and 46 percent of PB and MII rates, respectively. The highest survivability resulted from Cryotop and EMG groups and no significant difference was found between them. Vitrified oocytes using Cryotop had the highest cleavage and blastocyst rates. All of the mean rates for vitrified immature oocytes were significantly lower than that of control group (P<0.05). The results of this study showed the superiority of Cryotop device for vitrification of immature bovine oocytes.

Avaliou-se a eficácia de diferentes dispositivos de congelamento (envasamento em palhetas (EP), microscopia eletrônica de grade (MEG) e Cryotop) para vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos. Para tal, foram determinados o corpo polar, a metáfase II (MII), a viabilidade e as subsequentes taxas de desenvolvimento. Foram utilizados somente ovócitos com quatro ou cinco camadas de células do cumulus. Os ovócitos foram equilibrados em duas soluções de vitrificação - 1: DMSO (10 por cento) + etilenoglicol (EG; 10 por cento) por 30 a 45 segundos e 2: DMSO (20 por cento) + EG (20 por cento) + sacarose (0,5M) por 25 segundos -, transferidos para os dispositivos de congelamento e mantidos, por 10 dias, em nitrogênio líquido. Imediatamente após serem retirados do nitrogênio, os ovócitos foram removidos dos dispositivos e processados para maturação, fertilização e cultivo in vitro. Os ovócitos vitrificados com o Cryotop apresentaram as maiores taxas de extrusão do corpo polar (CP) e de maturidade nuclear (MII), 41 e 58 por cento, respectivamente. Para os ovócitos vitrificados com EP e MEG, as taxas de CP e as de MII foram, respectivamente, de 26 e 32 por cento e de 35 e 46 por cento. As taxas de viabilidade não diferiram entre os grupos Cryotop e EMG. Os ovócitos vitrificados com Cryotop apresentaram as maiores taxas de clivagem e de blastocisto. Para todas as variáveis estudadas, as taxas para os ovócitos vitrificados foram significativamente menores do que as do grupo-controle (P<0,05). Os resultados deste estudo mostraram a superioridade do dispositivo Cryotop para vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos.

Resistência de união e discrepância marginal absoluta de infraestruturas feitas em cerâmica Y-TZP: influência de novos métodos de tratamento de superfície / New approach for surface modification of a Y-TZP ceramic: resin bond strength quality, surface micro-morphological evaluations and marginal fit of Y-TZP frameworks

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes tratamentos de superfície da cerâmica Y-TZP na resistência de união, durabilidade e discrepância marginal. Para os testes de resistência adesiva, foram obtidos 144 corpos de prova (cp) da cerâmica VITA In-Ceram YZ for InLab (5,25 x 3,75 x 4,5 mm), que foram divididos em 6 grupos (G) (n=24), conforme o tratamento de superfície: G1: sem tratamento (controle); G2: jateamento com partículas de alumínio revestidas por sílica (CoJet®-Sand, 3M ESPE AG) (silicatização); G3: vitrificação 1 (Glaze Spray VITA AKZENT), condicionamento com ácido fluorídrico (HF) (1 min); G4: vitrificação 1 (Glaze Spray VITA AKZENT), silicatização; G5: vitrificação 2 (Glaze VITA AKZENT), condicionamento com HF (1 min); G6: vitrificação 2 (Glaze VITA AKZENT), silicatização. Após todos os tratamentos, as superfícies foram silanizadas por 5 min (ESPE-SIL) e a cimentação com Panavia F (Kuraray) foi realizada. Metade dos espécimes de cada tratamento foi ensaiada 24h após cimentação (SECO), a outra metade foi submetida à armazenagem (150 dias) e termociclagem (12.000x) (TC), e então realizado o ensaio de cisalhamento (1 mm/min). G7: G1+TC; G8: G2+TC; G9: G3+TC; G10: G4+TC; G11: G5+TC; G12: G6+TC. Superfícies tratadas foram analisadas por perfilometria óptica 3D para obtenção dos dados de rugosidade (Ra) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) (1000x). Análise por energia dispersiva de raio-X (EDS) foi realizada para determinar os elementos químicos presentes na superfície de cada grupo. Para a análise de adaptação marginal foram confeccionadas 60 infraestruturas (adaptadas em um troquel metálico) nas quais foram realizados os mesmos tratamentos de superfície. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente. Constata-se que tanto na condição Seco como na condição TC os grupos que receberam tratamento de superfície via vitrificação (vitrificação 1 e vitrificação 2) apresentaram mais alta resistência de união comparada ao grupo...

The aim of this study was to evaluate the effect of different surface treatments of Y-TZP ceramic on bond durability and marginal fit. 144 specimens of VITA In-Ceram YZ for InLab ceramic (5.25 x 3.75 x 4.5 mm) were obtained and divided into 6 groups (n=24) according to the surface treatment: G1: no treatment (control); G2: chairside tribochemical silica coating system (CoJet®-Sand, 3M ESPE AG) (Cojet); G3: vitrification 1 (Glaze Spray VITA AKZENT), conditioning with hydrofluoric acid (HF) (1 minute); G4: vitrification 1 (Glaze Spray VITA AKZENT), Cojet; G5: vitrification 2 (Glaze VITA AKZENT), conditioning with HF (1 minute); G6: vitification 2 (Glaze VITA AKZENT), Cojet. Then, the ceramic surfaces were silanized and the cement Panavia F (Kuraray) was applied. Half of the specimens from each treatment was tested 24 hours after cementation (DRY), the remaining specimens were stored in distilled water for150 days, thermocycled(12,000x) (AGING) and then the shear test was performed (1mm/minute). Conditioned surfaces were evaluated by 3D optical profilometry in order to obtain roughness data (Ra) and analysed by scan electronic microscopy (SEM) (1000x). Analysis by energy x-ray dispersive (EDS) was performed to determine the chemical elements present in each surface group. For analysis of marginal adaptation 60 crowns were produced (adapted into a metal die) and the same surface treatments were carried out on the internal surface of the crowns. The data were analysed using. The results suggest the vitrification 1 and vitrification 2 groups showed the highest bond strength compared to the control group. The highest marginal discrepancies were observed in the vitrification groups (117.36±29.61 to 105.78±12.23) comparing with the other groups (55.29±8.71 and 55.04±8.55). The proposed new surface treatment changed the Y-TZP ceramic morphology improving its adhesion to the resin cement...